Kačji strup vsebuje encime, ki hidrolizirajo karboksilne estrske vezi.Substrati za hidrolizo so fosfolipidi, acetilholin in aromatski acetat.Ti encimi vključujejo tri vrste: fosfolipazo, acetilholinesterazo in aromatsko esterazo.Arginin esteraza v kačjem strupu lahko hidrolizira tudi sintetični arginin ali lizin, vendar v naravi hidrolizira predvsem proteinske peptidne vezi, zato spada med proteaze.Tukaj obravnavani encimi delujejo samo na estrske substrate in ne morejo delovati na nobeno peptidno vez.Med temi encimi sta biološki funkciji acetilholinesteraze in fosfolipaze pomembnejši in v celoti raziskani.Nekateri kačji strupi imajo močno aktivnost aromatične esteraze, ki lahko hidrolizira p-nitrofenil etil ester, a – ali P-naftalen acetat in indol etil ester.Še vedno ni znano, ali to aktivnost povzroča neodvisen encim ali znan stranski učinek karboksilesteraze, kaj šele njen biološki pomen.Ko je strup Agkistrodon halys Japonicus reagiral s p-nitrofenil etil estrom in indol etil estrom, hidrolizatov p-nitrofenola in indol fenola niso našli;Nasprotno, če ti estri reagirajo s kačjim strupom podvrste kobre Zhoushan in kačjim strupom Bungarus multicinctus, bodo hitro hidrolizirani.Znano je, da imajo ti strupi kobre močno aktivnost holinesteraze, ki je lahko odgovorna za hidrolizo zgornjih substratov.Pravzaprav so Mclean et al.(1971) so poročali, da lahko številni kačji strupi iz družine Cobra hidrolizirajo indol etil ester, naftalen etil ester in butil naftalen ester.Ti kačji strupi izvirajo iz: kobre, črnovrate kobre, črnoustne kobre, zlate kobre, egiptovske kobre, kraljeve kobre, zlate kobre mambe, črne mambe in beloustne mambe (D. aw še vedno pozna vzhodno rombolasto klopotačo
Kačji strup lahko hidrolizira metil indol etil ester, ki je substrat za določanje aktivnosti holinesteraze v serumu, vendar ta kačji strup ne kaže aktivnosti holinesteraze.To kaže, da je v strupu kobre neznana esteraza, ki se razlikuje od holinesteraze.Za razumevanje narave tega encima je potrebno nadaljnje ločevanje.
1, fosfolipaza A2
(I) Pregled
Fosfolipaza je encim, ki lahko hidrolizira gliceril fosfat.V naravi obstaja 5 vrst fosfolipaze, in sicer fosfolipaza A2 in fosfolipaza
A. , fosfolipazo B, fosfolipazo C in fosfolipazo D. Kačji strup vsebuje predvsem fosfolipazo A2 (PLA2), nekaj kačjih strupov vsebuje fosfolipazo B, druge fosfolipaze pa najdemo predvsem v živalskih tkivih in bakterijah.Slika 3-11-4 prikazuje mesto delovanja teh fosfolipaz na hidrolizo substrata.
Med fosfolipazami je bolj raziskana PLA2.Morda je najbolj raziskan encim v kačjem strupu.Njegov substrat je estrska vez na drugem položaju Sn-3-glicerofosfata.Ta encim je široko prisoten v kačjem strupu, čebeljem strupu, strupu škorpijona in živalskih tkivih, PLA2 pa je v izobilju v kačjih strupih štirih družin.Ker ta encim razgrajuje rdeče krvne celice in povzroča hemolizo, se imenuje tudi "hemolizin".Nekateri imenujejo tudi PLA2 hemolitična lecitinaza.
Ludeeke je prvi ugotovil, da lahko kačji strup proizvede hemolitično spojino z delovanjem na lecitin prek encimov.Kasneje so Delezenne et al.dokazal, da ko kobrin strup deluje na konjski serum ali rumenjak, tvori hemolitično snov.Zdaj je znano, da lahko PLA2 neposredno deluje na fosfolipide eritrocitne membrane, uniči strukturo eritrocitne membrane in povzroči neposredno hemolizo;Prav tako lahko deluje na serum ali dodani lecitin, da proizvede hemolitični lecitin, ki deluje na rdeče krvne celice, da povzroči indirektno hemolizo.Čeprav je PLA2 veliko v štirih družinah kačjih strupov, je vsebnost encimov v različnih kačjih strupih nekoliko drugačna.Klopotača (C
Kačji strup je pokazal le šibko aktivnost PLA2.Tabela 3-11-11 prikazuje primerjavo aktivnosti PLA2 10 glavnih strupov strupenih kač na Kitajskem.
Tabela 3-11-11 Primerjava aktivnosti fosfolipaze VIII 10 kačjih strupov na Kitajskem
Kačji strup
Sproščanje maščobe
alifatska kislina,
Cjumol/mg)
Hemolitična aktivnost CHU50/^ g * ml)
Kačji strup
Sprostite maščobne kisline
(^raol/mg)
Hemolitična aktivnost (HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
enajst
Micracephal ofis
pet pika ena nič
kalyspallas
8. 68
dva tisoč osemsto
gracilis
V, akutus
7. 56
* * #
Ophiophagus hannah
tri pika osem dva
sto štirideset
Bnugarus fasctatus
7,56
dvesto osemdeset
B. multicinctus
ena pika devet šest
dvesto osemdeset
Viper a russelli
sedem pika nič tri
T, mucrosquamatus
ena pika osem pet
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
（2） Ločevanje in čiščenje
Vsebnost PLA2 v kačjem strupu je velika in je odporen na vročino, kisline, alkalije in denaturant, tako da ga je enostavno očistiti in ločiti PLA2.Običajna metoda je, da najprej izvedemo gelsko filtracijo surovega strupa, nato izvedemo ionsko izmenjevalno kromatografijo in naslednji korak lahko ponovimo.Opozoriti je treba, da sušenje z zamrzovanjem PLA2 po ionsko izmenjevalni kromatografiji ne bi smelo povzročiti agregacije, ker postopek sušenja z zamrzovanjem pogosto poveča ionsko moč v sistemu, kar je pomemben dejavnik, ki povzroča agregacijo PLA2.Poleg zgornjih splošnih metod so bile sprejete tudi naslednje metode: ① Wells et al.② Substratni analog PLA2 je bil uporabljen kot ligand za afinitetno kromatografijo.Ta ligand se lahko veže na PLA2 v kačjem strupu s Ca2+.EDTA se večinoma uporablja kot eluent.Po odstranitvi Ca2+ se afiniteta med PLA2 in ligandom zmanjša in ga je mogoče ločiti od liganda.Drugi kot eluent uporabljajo 30 % organsko raztopino ali 6 mol/l sečnine.③ Hidrofobna kromatografija je bila izvedena s PheiiylSephar0SeCL-4B za odstranitev sledi PLA2 v kardiotoksinu.④ Protitelo proti PLA2 je bilo uporabljeno kot ligand za izvedbo afinitetne kromatografije na PLA2.
Doslej je bilo prečiščenih veliko število kačjih strupov PLAZ.Tu et al.(1977) je navedel PLA2, prečiščen iz kačjega strupa pred letom 1975. V zadnjih letih je vsako leto objavljeno veliko število člankov o ločevanju in čiščenju PLA2.Tu se osredotočamo na ločevanje in čiščenje PLA s strani kitajskih učenjakov.
Chen Yuancong et al.(1981) je ločil tri vrste PLA2 iz strupa Agkistrodon halys Pallas v Zhejiangu, ki jih lahko razdelimo na kisle, nevtralne in alkalne PLA2 glede na njihove izoelektrične točke.Glede na svojo toksičnost je bolj toksičen nevtralni PLA2, ki je bil identificiran kot presinaptični nevrotoksin Agkistrodotoksin.Alkalni PLA2 je manj toksičen, kisli PLA2 pa skoraj ni strupen.Wu Xiangfu idr.(1984) so primerjali značilnosti treh PLA2, vključno z molekulsko maso, aminokislinsko sestavo, N-terminalom, izoelektrično točko, toplotno stabilnostjo, encimsko aktivnostjo, toksičnostjo in hemolitično aktivnostjo.Rezultati so pokazali, da imata podobno molekulsko maso in toplotno stabilnost, vendar sta imela pomembne razlike v drugih vidikih.Z vidika encimske aktivnosti je bila kisla encimska aktivnost večja od alkalne;Hemolitični učinek alkalnega encima na rdeče krvne celice podgan je bil najmočnejši, sledil je nevtralni encim in kisli encim, ki je bil težko hemoliziran.Zato se špekulira, da je hemolitični učinek PLAZ povezan z nabojem molekule PLA2.Zhang Jingkang et al.(1981) so naredili kristale Agkistrodotoksina.Tu Guangliang et al.(1983) so poročali, da je bil toksičen PLA z izoelektrično točko 7,6 izoliran in prečiščen iz strupa Vipera rotundus iz Fujiana, njegove fizikalne in kemijske lastnosti, aminokislinska sestava in zaporedje 22 aminokislinskih ostankov pri N -terminal so bili določeni.Li Yuesheng idr.(1985) izolirali in očistili še en PLA2 iz strupa Viper rotundus v Fujianu.Podenota PLA2 * je 13 800, izoelektrična točka je 10,4, specifična aktivnost pa 35/xnioI/miri mg。 Z lecitinom kot substratom je optimalni pH encima 8,0 in optimalna temperatura 65 °C LD5, injiciran intravenozno pri miših.Je 0,5 ± 0,12 mg/kg.Ta encim ima očitne antikoagulantne in hemolitične učinke.Toksična molekula PLA2 je sestavljena iz 123 ostankov 18 vrst aminokislin.Molekula je bogata s cisteinom (14), asparaginsko kislino (14) in glicinom (12), vendar vsebuje le en metionin, njen N-terminal pa je serinski ostanek.V primerjavi s PLA2, ki ga je izoliral Tuguang, sta molekulska masa in število aminokislinskih ostankov obeh izoencimov zelo podobna, prav tako je zelo podobna aminokislinska sestava, vendar je število ostankov asparaginske kisline in prolina nekoliko drugačno.Kačji strup kraljeve kobre Guangxi vsebuje bogat PLA2.Shu Yuyan et al.(1989) so iz strupa izolirali PLA2, ki ima specifično aktivnost 3,6-krat večjo od prvotnega strupa, molekulsko maso 13000, sestavo 122 aminokislinskih ostankov, izoelektrično točko 8,9 in dobro termično stabilnost.Iz opazovanja učinka osnovnega PLA2 na rdeče krvne celice z elektronskim mikroskopom je razvidno, da ima očiten učinek na membrano človeških rdečih krvnih celic, nima pa očitnega učinka na rdeče krvne celice koz.Ta PLA2 ima očiten učinek zaviranja elektroforetske hitrosti rdečih krvnih celic pri ljudeh, kozah, zajcih in morskih prašičkih.Chen et al.Ta encim lahko zavira agregacijo trombocitov, ki jo povzročajo ADP, kolagen in natrijeva arahidonska kislina.Ko je koncentracija PLA2 10/xg/ml ~ 100 jug/ml, je agregacija trombocitov popolnoma zavrta.Če bi kot material uporabili oprane trombocite, PLA2 ne bi mogel zavirati agregacije pri koncentraciji 20 mg/ml.Aspirin je zaviralec ciklooksigenaze, ki lahko zavre učinek PLA2 na trombocite.PLA2 lahko zavira agregacijo trombocitov s hidrolizacijo arahidonske kisline za sintezo tromboksana A2.Konformacijo raztopine PLA2, ki jo proizvaja strup Agkistrodon halys Pallas v provinci Zhejiang, so proučevali s pomočjo krožnega dikroizma, fluorescence in UV absorpcije.Eksperimentalni rezultati so pokazali, da je bila konformacija glavne verige tega encima podobna konformaciji iste vrste encima iz drugih vrst in rodov, konformacija skeleta je imela dobro toplotno odpornost in strukturna sprememba v kislem okolju je bila reverzibilna.Kombinacija aktivatorja Ca2+ in encima ne vpliva na okolje ostankov triptofana, medtem ko inhibitor Zn2+ deluje nasprotno.Način, na katerega pH vrednost raztopine vpliva na aktivnost encimov, se razlikuje od zgornjih reagentov.
V procesu čiščenja kačjega strupa s PLA2 je očiten pojav, da kačji strup vsebuje dva ali več vrhov elucije PLA2.Ta pojav je mogoče razložiti na naslednji način: ① zaradi obstoja izoencimov;② Ena vrsta PLA2 je polimerizirana v različne mešanice PLA2 z različnimi molekulskimi masami, od katerih je večina v razponu od 9 000 do 40 000;③ Kombinacija PLA2 in drugih komponent kačjega strupa zaplete PLA2;④ Ker je amidna vez v PLA2 hidrolizirana, se naboj spremeni.① In ② sta pogosta, le z nekaj izjemami, kot je PLA2 v kačjem strupu CrWa/w
Obstajata dve situaciji: ① in ②.Tretji pogoj je bil najden v PLA2 v strupu naslednjih kač: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, palestinski gad, peščeni gad in strašna klopotača km。
Zaradi rezultata primera ④ se med elektroforezo spremeni hitrost migracije PLA2, vendar se aminokislinska sestava ne spremeni.Peptide je mogoče razgraditi s hidrolizo, vendar so na splošno še vedno povezani z disulfidnimi vezmi.Strup klopotače vsebuje dve obliki PLA2, imenovani tip a in tip p PLA2.Razlika med tema dvema vrstama PLA2 je samo ena aminokislina, to pomeni, da je glutamin v eni molekuli PLA2 nadomeščen z glutaminsko kislino v drugi molekuli PLA2.Čeprav natančen razlog za to razliko ni jasen, se na splošno verjame, da je povezana z deaminacijo PLA2.Če se PLA2 v strupu palestinskega gada ogreje s surovim strupom, bo končnih skupin v njegovih encimskih molekulah postalo več kot prej.Iz C PLA2, izoliran iz kačjega strupa, ima dva različna N-terminala in njegova molekulska masa je 30000. Ta pojav lahko povzroči asimetrični dimer PLA2, ki je podoben simetričnemu dimeru, ki ga tvori PLA2 v strupu vzhodne diamantne klopotače in zahodna diamantna klopotača.Azijska kobra je sestavljena iz številnih podvrst, od katerih nekatere niso natančno razvrščene.Na primer, nekaj, kar se je včasih imenovalo Cobra Outer Caspian podvrsta, je zdaj priznano
Treba ga je pripisati kobri zunanjega Kaspijskega morja.Ker je podvrst veliko in so mešane, se sestava kačjega strupa zaradi različnih virov zelo razlikuje, visoka pa je tudi vsebnost izoencimov PLA2.Na primer strup kobre
Najmanj 9 vrst izoencimov PLA2 vrst r ^ ll je bilo najdenih v strupu podvrste kaspijske kobre pa 7 vrst izoencimov PLA2.Durkin et al.(1981) so preučevali vsebnost PLA2 in število izoencimov v različnih kačjih strupih, vključno z 18 strupi kobre, 3 strupi mambe, 5 strupi gada, 16 strupi klopotače in 3 strupi morske kače.Na splošno je aktivnost PLA2 kobrinega strupa visoka, z veliko izoencimi.Aktivnost PLA2 in izoencimi gadovega strupa so srednji.Aktivnost PLA2 strupa mambe in strupa klopotače je zelo nizka ali pa ni aktivnosti PLA2.Nizka je tudi aktivnost PLA2 strupa morske kače.
V zadnjih letih ni bilo poročil, da bi PLA2 v kačjem strupu obstajal v obliki aktivnega dimera, kot je vzhodna rombofora klopotača (kačji strup C. vsebuje PLA2 tipa a in tipa P, ki sta oba sestavljena iz dveh enakih podenot in samo dimeraza
dejavnost.Shen et al.tudi predlagal, da je samo dimer PLA2 kačjega strupa aktivna oblika encima.Študija prostorske strukture tudi dokazuje, da PLA2 zahodne diamantne klopotca obstaja v obliki dimera.Ribojeda spojina
Obstajata dva različna PLA ^ Ei in E2 kačjega strupa, v katerem 仏 obstaja v obliki dimera, dimer je aktiven, njegov disociirani monomer pa je neaktiven.Lu Yinghua et al.(1980) so nadalje preučevali fizikalne in kemijske lastnosti ter reakcijsko kinetiko E. Jayanthija et al.(1989) izolirali bazični PLA2 (VRVPL-V) iz strupa gada.Molekulska masa monomera PLA2 je 10000, ki ima smrtonosne, antikoagulantne in edemske učinke.Encim lahko polimerizira polimere z različnimi molekulskimi masami pod pogojem PH 4,8, stopnja polimerizacije in molekulska masa polimerov pa naraščata s povišanjem temperature.Molekulska masa polimera, ustvarjenega pri 96 °C, je 53 100, aktivnost PLA2 tega polimera pa se poveča za dva
Čas objave: 18. nov. 2022